En la actividad de Bio-Minds Poster Day, tuve la oportunidad de evaluar varios afiches de diferentes temas interesantes. La primera persona que visité fue Samaria Villalobos y el título de su proyecto fue Characterization of Cultivable Bacteria in Activated Sludge from the Adjuntas’s Wastewater Treatment Plant in Puerto Rico. El afiche  de Samaris fue uno sencillo con información breve de su investigación y coloridas figuras que eran fáciles mirar. El poster estaba organizado adecuadamente. Mi única critica fueron los resultados y la interpretación de resultados. Tuve duda en las bacterias que predominaban en el medio y el sustrato que preferían, le pregunté por qué ella creía que el substrato mannitol, era el preferido de los Enterococcus. Ella titubeo en las contestaciones de la pregunta, hubo algunas lagunas en el dominio del material y algunos detalles de las gráficas fueron confusas y dejaban preguntas abiertas sin contestar. Mi consejo para ella es que estudie bien su poster y se prepare para preguntas de cualquier índole. En general, el poster estuvo bueno, sólo tiene que mejorar un poco algunos detalles.

El segundo afiche fue del joven Josué G. Millán y el título de su proyecto lo fue Isolation and characterization of bioprospects from the Phytotelmata of the Pitcher Plant Nepenthes sp. Este afiche contó con información óptima y correcta. Definitivamente tenía conocimiento extenso de su proyecto, y lo demostró cuando contestó las preguntas, que más bien iban encaminadas hacia prospectos futuros del proyecto. En resumen su afiche estuvo excelente.

El último afiche que visité fue el del joven Alvin Cruz, su proyecto se titulaba Fabrication of biomedical devices  by e-beam lithography. Su proyecto era en un campo no muy familiar para mi, ya que había temas de construcciones de resinas y gráficas que requieren el conocimiento de la computación e ingeniería mecánica. Me gusto las aplicaciones que podría tener en el campo de la Neurociencia. De este afiche, mi única crítica es que la información a veces es muy “overwhelming” para una persona que no sea de ese campo y debe mejorar sus habilidades de digerir la información para el plebeyo jejejjeje! Por lo demás estuvo excelente!

Buenas! En este mes nos interesaba llevar a cabo la digestion del pVinc con MspA1I y los minigenomas positivo y negativo con PmeI. Luego de la digestion esperamos ligar ambos plasmidos para obtener las construccion deseada y asi poder medir la replicacion de LuIII. En este mes pudimos extraer los fragmentos deseados y disenamos estrategias para la ligacion de ambos plasmidos. En este diseno, tenemos que anticipar los posibles obstaculos que pudiesen la ligacion. Entre ellos tenemos que determinar la concentracion apropiada para la ligacion. Una ligacion cuyo corte es cercano a los terminales del virus podria ser perjudicial, ya que podria formarse invaginaciones del terminal que pueden bloquear la ligacion. El progreso en la investigacion ha sido bastante bueno, pero nos pone nervioso que podria pasar con la ligacion.

Abstract del Bio-Minds Poster Day

Study of replication ratio of parvovirus LuIII minigenomes in Hela cells

Franklyn Rocha, Idaris de Jesus-Maldonado, Nanette Diffoot
Department of  Biology-University of Puerto Rico Mayaguez

LuIII is an autonomous icosahedral parvovirus that contains a single stranded DNA genome and infects eukaryotic cell lines. It has been proposed that an AT-rich region located near the right termini and unique in LuIII could be an element responsible for its encapsidation pattern. Even though our lab has found that AT-rich region is important for LuIII replication, we need some way to quantify the efficiency of replication before we can study the packaging of its DNA. Given the cis-acting sequences required for LuIII DNA excision and initiation of replication reside in the left and right termini, two minigenomes containing either termini (3′LuIII-GFP5′) but one of the them lacking the AT rich sequence (3′LuIIIAT(-)GFP5′) were constructed. These minigenomes also contains the GFP gene to visualize its replication efficiency. Hela cells were transfected and will be observed in fluorescence microscope. A flow cytometer will be used to determine the differences in fluorescent intensities. The resulting evidence may provide clues of the importance of AT-rich region in LuIII replication and its encapsidation. Understanding the mechanisms that mediate LuIII replication can help generate effective treatments against abnormal cell growth, such as those seen in cancerous cells.

Este semestre planeamos construir los componentes del final de mi proyecto: el origen de replicacion de LuIII, junto con la ligacion del gen de GFP. Ya sabemos que enzimas requerimos para extraer el gen de vinculina, lo cual son las enzimas EcoRI y SlaI. Extraemos eso, mientras llegan las enzimas para sacar el origen de replicacion de LuIII.  Otra meta de este semestre es determinar los tiempos de incubacion a la cual la transfeccion en HeLa sera mas eficiente. Finalmente, la ultima meta es poder evitar un problema que pueda surgir por esta transfeccion: el virus morira primero o el huesped? Tenemos que evitar que el primero ocurra porque podra afectar grandemente nuestros resultados. Si hubiera mas tiempo, tambien nos interesa observar si hay alguna proteina estructural viral que podamos medir usando el GFP, ya que sabemos por la literatura, que LuIII debe tener un mecanismo de encapsidacion particular y seria bueno estudiarlo. Ahora, esto se investigaria si el tiempo amerita.

En resumen este semestre hare ligaciones para construir el plasmido con el ori de LuIII tagueado con el GFP, hare transfeccion en celulas HeLa y observare en un microscopio confocal lo que ocurre a diferentes tiempos. Esperamos que podamos contestar la pregunta que planteamos al principio del semestre anterior con resultados!

No aprendere ninguna tecnica nueva, ya yo he hecho ligaciones antes y la transfeccion es muy parecida a la transformacion excepto que una es en eucariotas y otras son en procariotas.

Bueno nos vemos en el Poster Day!

La extraccion de pGlu883 Reverse y AT- al fin fue exitosa. El proximo paso requiere la ligacion exitosa del DNA al vector GFP. Para lograr este objetivo utilizaremos las enzimas SexAI y Stu I para remover el ori y asi introducir los DNA extraidos. La diferencia entre un vector y otro es el peso molecular, la diferencia es de aproximadamente de 50bp. Se espera que el GFP de un vector (el que tenga el Reverse) tendra una intensidad de fluorescencia distinta de al vector qu tenga el otro vector ( el que tenga el p5). Una vez se obtiene los vectores deseados, se tiene que transfectar en las celulas HeLa para ver el efecto. Si sale todo como lo proyectado, podriamos tener una forma cuantificable de medir eficiencia de replicacion y de esa manera, podriamos confirmar la importancia de la region rica en AT en la replicacion.

Para el proximo semestre, tenemos proyectado hacer la ligacion, el vector de GFP “nuevo” llego hace unos pocos dias, mi meta antes de terminar el semestre es poder realizar al menos una de las dos ligaciones. Con lo impredecible que es la investigacion, uno nunca puedo contar que salga, pero eso intentare. Estamos encaminados hacia la meta y esperamos poder lograrlo el proximo semestre.

Tuve la oportunidad de ir a ABRCMS este semestre, pero fue auspiaciado por los programas de MARC/Sloan, sin embargo fue una experiencia positiva. Sin embargo, pude ver mucho de mis companeros ganar premios y me hizo sentir bien por la contribucion que ha tenido tanto MARC/Sloan como BioMinds.

Durante el mes de octubre, me dedique a la extraccion de los DNA del pGlu883 Xba Reverse y el pGlu883 Xba AT- o p5. Esto se logra por medio del corte de enzimas de restriccion, incluyendo BamHI. queremos aislar suficiente DNA para poder llevar a cabo ligacion al vector de GFP y poder medir eficiencia de replicacion utilizando la fluorescencia. Ante el problema del vector de GFP, mi mentora tomo la decision de eliminar este vector regalado y ordeno que se comprara un vector de GFP nuevo, lo que fue una decision dificil, ya que significa que el tiempo que inverti caracterizando el GFP, fue en vano… Mientras a finales de octubre se ordeno ese vector de GFP nuevo, lleve acabo varios cortes con BamHI para obtener los DNA, y purificarlos. Surgio un problema con el pGlu Reverse ya que no pude extraer suficiente DNA para extraccion del “Gel extraction” lo que implica que tengo que repetir la extraccion del reverse. El pGlu AT- fue una extraccion existosa. Se pudo lograr un 60% de las metas.
Necesitamos tener ambos DNA para proseguir a la ligacion donde sacariamos el origen de replicacion del GFP y lo reemplazariamos por nuestro DNA. Bueno les dire mas detalles el proximo mes! Hasta luego

En el ultimo post, habia comentado que tenia un proyecto nuevo. En este proyecto nuevo tengo que construir un vector que sea la cede del origen de replicacion del virus LuIII, para estudiar la importancia de la region de AT en los patrones de emcapsidacion del virus. El laboratorio ha estudiado en el pasado que remover la region de AT en el virus no es causa suficiente para detener la replicacion lo que implica que esa region quizas es importante en otro proceso, como la encapsidacion. Saber los patrones de encapsidacion del virus puede proveer informacion util y crear un modelo que pueda aplicarse a otros viruses patogenicos que tengan caracteristicas similares a LuIII.

Hemos podido cumplir con un 60% de las metas. Las mayores dificultades ocurrio caracterizando las regiones del vector que tenia un tag de GFP. Este es el vector donde vamos a introducir el DNA viral de LuIII por medio de una transfeccion. El problema fue que la persona que proveyo el vector-GFP nos dio la informacion incorrecta sobre los fragmentos que se generaban con diferentes cortes de enzimas de restriccion. Esto significa, que tuvimos que probar cortes con diferentes enzimas para determinar si ese vector era elegible para nuestro proposito.

Mientras tanto, lleve a cabo una extraccion de DNA viral que se utilizaria para hacer una transfeccion en celulas HeLa. Nos dedicaremos el asunto con el vector y veremos a ver que pasa, hasta luego!

El verano pasado fue una experiencia enriquecedora para mi vida profesional. Estuve en la Harvard University bajo la mentoría de la Dra. Mel Feany MD PhD trabajando con neurodegeneración en modelos de Drosophila. La hiperfosforilación de tau y la deposición de placas de beta amiloide son causantes de neurotoxicidad en enferemedades neurodegenerativas, entre ellas Alzheimer y Parkinson. Mi proyecto tenía un enfoque genético y molecular ya que cruzé moscas con diferentes genotipos para coexpresar mutantes de Beta amiloide y tau a la vez. Esto se puede llevar a cabo gracias a un sistema de biexpresion llamado GAL4/UAS, que permite manejar la expresión genética en tejidos específicos. Nosotros utilizamos el promotor GMR para expresar la neurodegeneración en la retina. El laboratorio construyó mutantes de sitios de Ser/Thr a Ala. Al fosforilarse en exceso los sitios de Ser/Thr, ocurre toxicidad en el cerebro. Mi laboratorio averiguó que mutaciones individuales de sitios de Ser/Thr en tau no detenía la neurotoxicidad, sin embargo si se mutaban todos los sitios de Ser/Thr, se reducía significativamente la neurotoxicidad. Mi laboratorio también encontró que moscas que expresaban Abeta-tau presentaban mayor toxicidad que las que expresaban tau o Abeta solamente. Esto sugiere que Abeta sinergéticamente aumenta la toxicidad de tau hiperfosforilado. Mi labor del verano era averiguar si había algún sitio de Ser/Thr era importante para la interacción entre Abeta y tau. Fue una experiencia que solidificó mi interés en la Neurociencia y mi intención de hacer un MD-PhD.

Ahora he vuelto al lab y tengo un proyecto nuevo (relacionado al anterior) en donde voy a investigar como se encapsida LuIII y ver si una región de Adenina-Timina es importante para la encapsidación de la hebra positiva y la hebra negativa. El objetivo de este semestre es construir el vector que no contenga la AT y poderlo taguearlo con GFP ya que será importante en el proceso de selección. Por ahora no sé más detalles, pero ya sabrán para el próximo blog! Hasta luego

La paciencia es una de las virtudes claves, que a veces olvido cuando trabajo en el laboratorio. Tiendo a ser impaciente y quiero ver resultados rápidos y concisos y a veces me frustro cuando no veo lo que quiero. Si hay algo que he aprendido es que tengo que relajarme, a veces las cosas no salen como uno quiere no porque has cometido errores, sino por otros factores aleatorios que estáan fuera de nuestro control. Esto es algo que tengo que aprender poco a poco. El próximo semestre mi expectativa es que me pongan a trabajar con algo diferente, quizás con el mismo LuIII, pero algo que requiera aprender cosas nuevas. Trabajar como subgraduado en un laboratorio es un proceso parecido a la absorción de agua de una esponja: captar todo lo que se observa, las técnicas que se llevan a cabo, el trabajo de otros más sabios que tú, que te enseñen donde te tropiezas y te ayuden en el camino de ese largo tramo que nos queda como científicos en nuestras vidas.

Las barreras más grandes para hacer investigación en un laboratorio en Puerto Rico no es secreto, el dinero, el dinero y el dinero. Siempre faltará algún material que llega atrasado, pues así es la burocracia. De mis barreras académicas, es que aunque conozco lo básico de los virus, todavía es dificultoso manejar desde un esquema complejo como funciona LuIII en su replicación desde un punto molecular. A lo mejor un curso que me daría una base sólida sería Genética Molecular Eucariota, lo cual estoy ansioso por tomar y aprender un poco más y integrarlos con mis conocimientos de Virología y de Bioquímica, clases que han sido claves para mi desarrollo académico.

                        Este semestre pude hacer otro Southern Blot y refresque la técnica, cada vez que lo hago me siento más confiado con la técnica. Creo que en mi vida voy a utilizar mucho las técnicas de blots, especialmente el Western! Creo que ahora mismo estoy en una etapa en donde creo que necesito calmarme y no desear que las cosas ocurran por la fuerza, a veces los descubrimientos en un laboratorio ocurre cuando se tira un poco de espontaneidad en los protocolos y se ajusta por medio de “trial and error” (aunque no es lo más divertido) para tener mejores resultados cada vez. El proceso de éxito en la investigación es lento y tengo que acostumbrarme a eso, no es fácil, pero con el apoyo de mis compañeros, mentora y especialmente la persona que más confío en el laboratorio profesionalmente, la técnica de laboratorio, podré superarlo!

Las tecnicas que he aprendido o que estoy puliendo son:

-Construir un mapa teorico de corte de enzimas de restriccion  con NEB cutter

-Llevar a cabo diferentes metodos de purificacion, dependiendo si termine una infeccion, un corte con una enzima de restriccion, entre otros

- Aprender a utilizar una autoclave de las guacaras viejas

- Organizar apropiadamente las cosas en el laboratorio y en la libreta

-Reconocer las bandas que aparecen en la gel con cortes de LuIII con MluI y HpyI

- Diferencias entre una extraccion Hirt y no Hirt

-Southern Blot

-Entre otros

Dos de mis compañeros eran químicos, una de ellas trabaja con Mayra Cádiz con cisplatin, una droga que es anti-cáncer y el otro trabaja con PAH’s que son unos hidrocarburos aromáticos.  El blog de Magdelisse  a diferencia de los otros, era en ingles lo que  ayudo a atraer a otro tipo de público general.  Su tema tiene una gran relevancia.  Nelson también presento un tema importante que es la mutación de DNA por compuestos químicos, específicamente los PAH’s.  José Javier  le añadió la presentación de su journal club lo cual estuvo cool y las imágenes estuvieron buena y quien no puede hablar bien de cerevisae? Sin ella el mundo no sería tan divertido.